کلونینگ قسمت ایمونوژنیک توکسین a/b کلستریدیوم دیفیسیل در باکتریهای اسید لاکتیک

باکتری کلستریدیوم دیفیسیل عامل ایجاد عفونت بیمارستانی و کولیت کاذب است که در حال گسترش بوده و در آمریکا و اتحادیه اروپا سالانه بالغ بر هفت میلیارد دلار هزینه در بر دارد. تاکنون واکسن اثبات شده-ای برای جلوگیری از اثر این باکتری معرفی نشده است. با توجه به نقش توکسین¬ها در بیماری¬زایی این باکتری اطلاعات زیادی در زمینه توکسین¬هایی که توسط این باکتری تولید می¬شود حاصل شده است. دو توکسین اصلی tcda و tcdb از زمانیکه به عنوان عامل اصلی حدت کلستریدیوم دیفیسیل مورد شناسایی قرار گرفتند مورد مطالعه گسترده¬ای قرار گرفتند. بیماری¬های مرتبط با باکتری کلستریدیوم دیفیسیل زمانی رخ می دهد که فلور طبیعی روده دچار دگرگونی شده و به باکتری کلستریدیوم دیفیسیل اجازه رشد و نمو در روده داده شود. که در ادامه باکتری توکسین تولید کرده و باعث ایجاد اسهال آبکی می¬شود. مصرف بی¬رویه آنتی¬بیوتیک-ها نظیر پنی¬سیلین (آمپی¬سیلین)، کلیندامایسین و سفالوسپورین¬ها ممکن است که باعث بهم خوردن باکتری¬های طبیعی روده شده و خطر تکوین اسهال ناشی از کلستریدیوم دیفیسیل را افزایش دهد. پروبیوتیک¬ها میکروارگانیسم¬های زنده¬ای هستند که تأثیرات مفیدی روی سلامتی انسان و حیوان دارند. باکتری لاکتوکوکوس لاکتیس، عضو شاخص باکتری¬های اسید لاکتیک می¬باشد که ویژگی¬های آن به طور کامل بررسی شده¬ است. l. lactis برای تولید پروتئین¬های زیستی مفید و برای انتقال dna پلاسمیدی به سلول-های یوکاریوتی مناسب می¬باشد. اخیراً l. lactisبه عنوان اولین ارگانیسم تغییر یافته¬ی ژنتیکی زنده برای درمان بیماری¬های انسانی استفاده شده است. توکسین b از طریق ناحیه اتصالی پذیرنده (rbd) به گیرنده خود در روده متصل می¬شود و این ناحیه قسمت ایمنی¬زای توکسین شناخته می¬شود ولی در عین حال قسمت بیماری¬زای آن محسوب نمی¬شود. به همین منظور در این تحقیق سعی بر کلون کردن این قسمت از توکسین(rbd) در باکتری l. lactis شد تا از این باکتری پروبیوتیک بتوان برای تولید این قطعه بهره گرفت. با کلون کردن و بیان این قطعه (rbd) می¬توان استفاده از باکتری را به عنوان یک واکسن خوراکی مورد بررسی قرار داد. برای کلون کردن این قطعه ابتدا با استخراج dna از باکتری کلستریدیوم دیفیسیل و با پرایمرهای طراحی شده، قطعه rbdبا استفاده از pcr تکثیر شد. در ادامه این قطعه تکثیر شده توسط کیت استخراج dna از ژل استخراج شد. سپس در پلاسمید ptz57r/t الحاق شده و در باکتری e.coli توسط شوک حرارتی ترانسفورم شد. با استخراج پلاسمید ptz57r/t حاوی قطعه از باکتری، با برش آنزیمی توسط آنزیم¬های ncoi و saci قطعه rbd از پلاسمید خارج شده و توسط کیت استخراج dna از ژل قطعه خالص سازی شد. قطعه خارج شده در مجاورت پلاسمید pnz8149 که با آنزیم¬های مشابه برش خورده تحت شرایط مناسب جهت الحاق قرار داده شد. بعد از عمل الحاق، پلاسمید حاوی قطعه با روش الکتروپوریشن وارد سلولهای مستعد از پیش آماده شده l. lactisشد. در ادامه این باکتری¬های الکتروپوریشن شده در محیط مغذی رشد داده شد. باکتری از روی محیط الیکر با توجه به تولید رنگ زرد که شاخصه وجود پلاسمید است غربالگری شد و در مرحله بعد پس از استخراج پلاسمید، با انجام هضم آنزیمی، pcr و تعیین توالی صحت کلونینگ تایید شد.